Aktuell werden akute Covid19-Erkrankungen anhand eines PCR-Testverfahrens festgestellt. Erläutere dieses Verfahren

Das PCR Testverfahren

Das PCR Testverfahren beruht auf der Polymerase-Kettenreaktion (“polymerase chain reaction”), und wurde 1983 von Kary Mullis, auf Basis einer ursprünglich in den 1970er Jahren von Kjell Kleppe entwickelten Idee, publiziert. Mullis wurde für seine Entdeckung 1993 der Nobelpreis für Chemie verliehen.

PCR Tests zielen darauf ab, kleine Mengen an doppelsträngiger DNA einer Probe in vitro zu vervielfältigen (“amplification”), bis genug davon besteht, um es in in Laboranalysen nachweisen zu können.

Dadurch kann zum Beispiel in einem SARS-CoV-19 Test bestimmt werden, ob die Person, welcher die Probe durch Abstrich entnommen wurde, an einer akuten Virusinfektion leidet. Da nur aktuell im Organismus befindliche DNA des Virus bestimmt werden kann ist dies ein Akuttest, das heißt, nach Abklingen der Infektion kann diese nicht mehr retroaktiv nachgewiesen werden. Um eine bereits überstandene Infektion nachweisen zu können, müssen Antikörpertests verwendet werden, siehe nächstes Kapitel.

Ablauf

PCR Tests beruhen auf einem mehrschrittigen Prozess und mehreren Zyklen:

Der erste Schritt der PCR besteht darin, den sogenannten Primer spezifisch für die zu bestimmende DNA Sequenz zu finden und zu erzeugen. Primer bestehen aus kurzen Oligonukleotid DNA-Sequenzen, die genau zu den Enden der zu bestimmenden DNA-Probe passen. Die Verwendung von Primersequenzen ist sozusagen der Trick, um ein bestimmtes DNA-Stück zu finden, zu amplifizieren und nachzuweisen.
Sobald der Primer vorliegt, besteht der nächste Schritt darin, die Probe so zu erhitzen, dass sich die doppelsträngige DNA in zwei Einzelstränge auftrennt- dieser Prozess wird als Denaturierung bezeichnet.
Dann werden die Primer mit der Proben-DNA kombiniert, diese hybridisieren mit den spezifischen Bindungsstellen, und lagern sich an diesen an, das sogenannte "Annealing" findet statt.
Anschließend wird eine DNA-Polymerase verwendet, um die DNA-Replikation an der Primerstelle zu starten, hierdurch verlängert sich das DNA Fragment ("elongation"), und es bilden sich wieder DNA Doppelstränge.
Zuletzt wird die DNA Sequenz erneut erhitzt, um die Stränge noch einmal zu trennen. Damit beginnt der gesamte PCR-Prozess von vorne in einem neuen Zyklus.

Durch den wiederholten Prozess nimmt die Menge des gesuchten DNA-Segments in der Probe mit jedem Zyklus exponentiell zu. Im ersten Zyklus wird aus einer Kopie zwei. Dann werden aus zwei Kopien vier, dann acht usw. Dieses exponentielle Wachstum bedeutet, dass im Allgemeinen nur 20 bis 40 Zyklen erforderlich sind, um festzustellen, ob die betreffende DNA vorhanden ist.

Abb.25: Schritte und Zyklen der Polymerase-Kettenreaktion

Automatisiertes Verfahren durch Thermocycling

Alle Schritte einer Polymerasekettenreaktion; die Denaturierung der DNA, das Aufbringen der Primer und Verlängerung der DNA, finden bei unterschiedlichen Temperaturen statt. Das heißt, nachdem die anfängliche Mischung zusammengesetzt wurde, können die Schritte durch einen automatisierten Prozess gesteuert werden, welcher als Thermocycling bekannt ist. Thermocycling bedeutet, dass die Temperatur gerade so lange auf dem erforderlichen Niveau gehalten wird, bis jeder Schritt stattfindet.

Abb.26: Thermocycling der Polymerase-Kettenreaktion

Somit ist die PCR ein effizienter Weg, um die Menge an Ziel-DNA zu vervielfältigen. In der Praxis kann der PCR Test in einem einzigen Reagenzglas automatisiert durchgeführt werden, ohne dass ein menschliches Eingreifen erforderlich ist. Hierdurch ist er im Vergleich zu alternativen Verfahren relativ kostengünstig, und wird daher in groß angelegten Laboren für Massentests benutzt.

Antikörpertests (ELISA)